Nació el 12 de agosto de 1911 en Santa María la Redonda, Ciudad de México.
En 1928, entró en el Ejército Mexicano. El 23 de mayo de ese mismo año, su padre solicitó formalmente su baja, alegando que su hijo tenía 16 años y no 21, tal y como había señalado para alistarse.
Estudió medicina para complacer a su padre, pero debido a la mala situación económica que vivía, tuvo que abandonar los estudios para ganarse la vida.
Después de un intento fallido de entrar a los Estados Unidos por California, se convirtió en boxeador. Fue también limpiabotas, maletilla, cartero y taxista.
Se enroló en una carpa de cómicos ambulantes en 1925. Fue miembro de las carpas Ofelia, Sotelo y Valentina, donde conoció a su esposa.
Interpretó pequeños papeles en espectáculos de variedades (fue también torero cómico). Sin embargo, pronto su talento fue reconocido empezando a hacer papeles protagonistas y a actuar en el teatro.
El actor Manuel Medel afirmó en varias entrevistas que Cantinflas, el legendario personaje interpretado por Mario Moreno, fue inspirado por un borrachito que conoció cuando trabajaba en el teatro Follies. Se llamaba Olegario y trabajaba como barrendero en el mencionado teatro. Cuando lo veían venir, Mario Moreno le pedía a Medel que lo provocara para hacerlo hablar, el hombre decía cosas incoherentes y repetitivas. Respecto al nombre, el escritor Carlos Monsiváis sostiene que se lo dio un espectador, que al escucharlo hablar y hablar sin sentido le gritó la frase "¡Cuánto inflas!", que se redujo a Cantinflas.
Inventor del cantinflismo, una teoría vacía, incongruente y disparatada de interpretar el lenguaje, con mezclas de muletillas coloquiales y términos cultos mal empleados.
Su carrera cinematográfica comenzó en la publicidad, terreno en el que se hizo tan popular que junto al productor ruso Jacques Gelman formó su propia compañía productora cinematográfica: Posa Films. Gelman, que producía, dirigía y distribuía, mientras él actuaba.
Debutó en el cine en 1936, y dejó en su filmografía casi 50 cintas. Se le otorgó la estrella número 1722 del Paseo de la Fama de Hollywood. Recibió dos nominaciones al Globo de Oro en la categoría de mejor actor y tuvo el reconocimiento a los logros de su vida por parte de la Academia Mexicana de Artes y Ciencias Cinematográficas.
Se le nombró Embajador de la Paz por la Organización de Estados Americanos (OEA), en reconocimiento a su "brillante labor de acercamiento entre los pueblos del mundo".
El 27 de octubre de 1936 se casó con Valentina Ivanova Zubareff, de origen ruso, y con la que permaneció hasta su fallecimiento en enero de 1966. Tuvo un hijo en 1961 con otra mujer; el niño fue adoptado por Valentina y fue llamado Mario Arturo Moreno Ivanova.
Mario Moreno falleció el 20 de abril de 1993 en su domicilio de Ciudad de México, rodeado de sus familiares y sin sufrir. Un cáncer de pulmón, detectado mes y medio atrás, le obligó a pasar sus últimos días en cama.